Überblick über Western BlottingWestern Blotting ist eine Technik zur Identifizierung von Proteinen in einer Probe, bei der Gelelektrophorese zur Trennung der Probenproteine eingesetzt wird. Diese Technik hat der biomedizinischen Wissenschaft neue Wege eröffnet, da sie einen hochpräzisen Ansatz für den Nachweis von Proteinen bietet. Western Blotting hat sich bei der Erkennung von klinischen Anzeichen der Lyme-Krankheit und von HIV als äußerst hilfreich erwiesen. In dieser Serie werden wir die Grundlagen des Western Blotting erläutern und einen Überblick über die Ausrüstung und die Techniken für einen erfolgreichen Blot geben. In diesem ersten Teil erhalten Sie eine Einführung in den Prozess der Elektrophorese sowie in die Auswahl von idealen Transfersystemen und Pufferlösungen. Was ist ein Western Blot?Western Blot ist ein Verfahren zum Nachweis spezifischer Proteine in einer komplexen, aus Zellen oder Geweben extrahierten Proteinmischung. Dieses biomedizinische Verfahren geht auf das Jahr 1979 zurück und ist heute der Industriestandard für die Proteinanalyse. Western Blot wurde bei bahnbrechenden Entdeckungen bei der Untersuchung der Lyme-Krankheit und der bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE) sowie von Komplikationen bei der Nährstoffaufnahme eingesetzt. Der Workflow beim Western Blotting besteht aus drei Hauptschritten: Trennung nach Größe, Übertragung auf einen stabilen Träger und Visualisierung mit geeigneten Antikörpern. Einfach ausgedrückt: Western Blotting ist das Verfahren zur Identifizierung von Proteinen durch elektrophoretische Trennung. Dazu werden die Proteine von einem Gel auf eine Membran übertragen, auf der die gewünschten Proteine genau nachgewiesen werden können. Die Membran wird mit Antikörpern behandelt, die Epitope an das Zielprotein binden. Nach einer Behandlung mit einem zweiten Antikörper können die Zielproteine in der Probe mithilfe von Nachweistechniken wie der verstärkten Chemilumineszenz (ECL) sichtbar gemacht werden. Es handelt sich dabei um einen aufwendigen Prozess, der mehrere Inkubations- und Waschschritte erfordert. Mit der richtigen Expertise und Technik können Sie jedoch den Zeitaufwand sowie die Menge an Reagenzien und Proben reduzieren. Elektrophoretische Trennung von ProteinenDie Elektrophorese ist ein Verfahren zur Trennung von Partikeln in einem Gelsubstrat durch Beeinflussung der Ladung der Partikel mit einem elektrischen Feld. Dies ist ein gängiges Verfahren, das von Biochemikern und Molekularbiologen eingesetzt wird, um das Vorhandensein eines bestimmten Proteins in einem komplexen Probengemisch nachzuweisen und zu isolieren. Die Elektrophorese ist eine Technik zur Trennung von Proteinen nach ihrer Ladung. Sie kann verwendet werden, um die Zusammensetzung komplexer Proteingemische zu untersuchen oder die Reinheit von Proteinproben zu überprüfen. Die Trennung durch Elektrophorese kann auch eingesetzt werden, um Proteine für weitere Anwendungen zu reinigen. Die Gelelektrophorese kann zum Beispiel zur Trennung von Nanopartikeln und insbesondere von Makromolekülen (DNA, RNA, Proteine) dienen. Das Gel wird während der Elektrophorese als antikonvektives oder siebendes Medium verwendet, was die Isolierung und Analyse von Makromolekülen auf der Grundlage ihrer Größe erleichtert. Bei der Vorbereitung einer elektrophoretischen Trennung sind einige Variablen zu berücksichtigen. Es ist wichtig, je nach Zusammensetzung des Probenmaterials und den Zielen für Ihre gereinigte Probe die richtigen Parameter für eine erfolgreiche Trennung zu kennen. Variablen wie Porengröße, Proteinladung und Form bestimmen die Migrationsrate des Proteins. Bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese wandern die Proteine als Reaktion auf ein elektrisches Feld durch die Poren in einer Polyacrylamid-Gelmatrix, wobei die Porengröße mit zunehmender Acrylamidkonzentration abnimmt. Die Gelelektrophorese bietet den Vorteil, dass das Gel leicht zu gießen ist und die Probe nicht denaturiert. Bei richtiger Handhabung kann eine Probe nach der Verarbeitung wiedergewonnen werden. Wenn das Gel jedoch während der Elektrophorese schmilzt, kann der Puffer erschöpft sein, was dazu führt, dass das Probenmaterial in unvorhersehbaren Formen läuft. Übertragen der Proteine auf eine MembranDer nächste Schritt beim Western Blotting nach der Elektrophorese ist das Übertragen der Proteine. Die Proteine werden von einer Gelmatrix auf einen synthetischen Membranträger übertragen, wo sie gebunden werden und den Blot bilden. Dies geschieht in der Regel durch elektrophoretischen Transfer. Die Membran und das Gel werden zusammen mit einer Barriere aus Filterpapier zwischen den beiden Elektroden platziert. Dann wird zwischen den Elektroden eine Spannung angelegt, die die Proteine veranlasst, dem Strom folgend zur Membran zu wandern. Die Geschwindigkeit der Elution der Proteine aus dem Gel wird durch die Stärke des elektrischen Feldes (gemessen in V/cm) bestimmt. Die Transferbedingungen hängen vom Molekulargewicht der Zielproteine ab und müssen beachtet werden, damit eine Probe weder zu wenig noch zu viel transferiert wird. Je nach Ihren Bedürfnissen gibt es eine Reihe von Optionen für Transfersysteme. TanktransfersystemeDer Tanktransfer ist die am weitesten verbreitete Methode und bietet die größte Bandbreite an Leistungseinstellungen und Transferzeiten (von 30 Minuten bis über Nacht) sowie integrierte Kühlsysteme. Diese Eigenschaften ermöglichen die Handhabung eines breiten Spektrums von Molekülgrößen. Gele und Membranen werden in diesem System vollständig eingetaucht und erfordern 1–12 l Puffer und manuelle Montage. Halbtrockene SystemeBei den halbtrockenen Systemen werden Gele und Membranen zwischen mit Puffer befeuchteten Filterpapieren platziert, die in direktem Kontakt mit flachen Plattenelektroden stehen. Sie sind im Vergleich zu Tanksystemen etwas einfacher einzurichten und erfordern nur eine gewisse manuelle Montage. Da sie nicht gekühlt werden können, gibt es einige Einschränkungen bei der Leistung und den Transferzeiten (15–60 Minuten). Diese Systeme sind ideal für Moleküle im Bereich von 30–120 kD und benötigen nur 250 ml Pufferlösung pro Blot. SchnelltransfersystemeSchnelltransfersysteme sind die neueste Technologie auf dem Markt und bieten die schnellsten Transferzeiten (3–10 Minuten). Ähnlich wie beim traditionellen halbtrockenen System werden bei Schnelltransfersystemen Filterpapiere und Membranen verwendet, die bereits angefeuchtet und in einer Verpackung für den Einmalgebrauch vorbereitet sind. Dies vereinfacht den Aufbau des Transfer-Stack und erfordert nur minimale oder gar keine manuellen Einstellungen. Halbtrockene Transfertechniken ermöglichen eine stärkere Anpassung der Transferparameter, was sie für eine breite Palette von Probenmolekulargewichten praktischer macht. Es ist kein zusätzliches Pufferreagenzz erforderlich. Blockieren unspezifischer Stellen
Um genaue Ergebnisse zu gewährleisten, ist neben dem Waschen und der Inkubation der Antikörper das Blockieren die wichtigste Phase des Western Blotting. Das Blockieren ist in der Phase der Immunodetektion beim Western Blotting von entscheidender Bedeutung, da es die unspezifische Bindung von Antikörpern an die Blotting-Membran verhindert. Nach dem Transfer der Proteine vom Gel ist es wichtig, die verbleibende Oberfläche der Membran zu blockieren, um eine unspezifische Bindung der Antikörper zu verhindern. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ergebnisse lesbar sind. Das Blockieren erfolgt häufig mit 5%igem Rinderserumalbumin (BSA) oder fettfreier Trockenmilch, die in trisgepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) verdünnt wurde, um den Hintergrund zu reduzieren und die Ergebnisse deutlich zu machen. Abhängig von den verwendeten Nachweisetiketten sind Milchproteine oft keine kompatible Lösung für das Blockieren. Das Verständnis dieser Kompatibilität ist wichtig für ein praktikables Western Bloting. Waschpuffer-FormulierungenDie Wahl der besten Waschpufferlösung für das Blockieren ist für einen erfolgreichen Blot entscheidend, da die verschiedenen Lösungen Vor- und Nachteile bieten. Dies hängt von drei Faktoren ab: dem gewünschten Protein, dem Antikörper und dem verwendeten Detektionssystem. Theoretisch können Sie jeden Puffer verwenden, der keine Affinität zur Bindung mit dem Zielprotein oder den Probenkomponenten hat. Einige Pufferlösungen werden jedoch besser funktionieren als andere. Wenn Sie zum Beispiel Biotin- und AP-Antikörper-Markierungen zusammen mit Antiphosphoprotein-Antikörpern verwenden, wären BSA-Blockierlösungen die ideale Wahl. Da Milch Kasein (ein Phosphoprotein und Biotin selbst) enthält, würde eine Lösung auf Milchbasis für das Blockieren die Testergebnisse beeinträchtigen. Es gibt mehrere gängige Blockierpuffer, die beim Western Blotting verwendet werden:
- Magermilchpulver
- Rinderserumalbumin (BSA)
- Normales Serum (fötales Serum von Kalb, Kaninchen, Pferd oder Ziege)
- Fischgelatine
- Gereinigtes Kasein
- Polyvinylpyrrolidon (PVP)
- Kommerzielle Puffer
Die am häufigsten verwendete kommerzielle Pufferlösung ist Natriumdodecylsulfat (SDS), obwohl der SDS-Puffer bei der Arbeit mit einigen Proteinen einige Komplikationen mit sich bringt. Es wurde berichtet, dass Proteine wie Immobilon-P in Gegenwart von SDS die Membranebene durchdringen. In Fällen, in denen die Proteine zur Ausfällung neigen, ist SDS ein erfolgreicher Puffer. Bei der Durchführung eines Western Blot enthalten einige Pufferlösungen einen Prozentsatz an Methanol, was Vorteile, in einigen Fällen aber auch Einschränkungen mit sich bringt. Das Methanol hilft beim Ablösen von SDS von Proteinen, die von denaturierenden SDS-haltigen Polyacrylamidgelen übertragen wurden. Dies stabilisiert die Geometrie des Gels während des Transferprozesses und kann die Bindungskapazität der Proteine an die Nitrocellulose (NC) in der Membran erhöhen. Methanol unterstützt ebenfalls die Bindung von Proteinen an die Membran. Methanol ist nicht geeignet, um Proteine mit hohem Molekulargewicht zu übertragen oder die Enzymaktivität zu erhalten. Das liegt daran, dass Methanol dazu neigt, das Gel zu schrumpfen. Der nicht-methanolische Transfer ist auch ideal für den Transfer konformationsspezifischer Antikörper. Wenn Sie mit einem Puffer mit niedriger Ionenstärke ohne Methanol arbeiten, ist es wichtig, das Gel vor dem Transfer für 30–60 Minuten zu inkubieren. Auf diese Weise vermeiden Sie das Risiko einer Quellung, die die Banden verzerren und die Ergebnisse schwer lesbar machen kann. In den meisten Fällen ist es ratsam, den primären Antikörper mit BSA zu inkubieren, da er in der Regel in größeren Mengen benötigt wird als der sekundäre Antikörper. Auf diese Weise kann der Antikörper wiederverwendet werden, wenn der Blot kein brauchbares Ergebnis liefert. Fazit Western Blotting ist eine komplexe Technik zum Nachweis von Proteinen. Avantor verfügt jedoch über die Ressourcen für eine reibungslose Durchführung Ihres Western-Blotting-Projekts. Avantor unterstützt Sie bei der Auswahl der besten Western Blot-Technologie auf dem Markt. Wir gewährleisten eine reibungslose Beschaffung, damit Sie sich darauf konzentrieren können, Ihrem Team perfekte Bedingungen für Innovationen bereitzustellen. |
